抗體是生命科學(xué)研究較為廣泛工具之一，抗體目前面臨一個問題——交叉反應(yīng)。ELISA可以定量多種樣品基質(zhì)（包括生物樣品）中的蛋白質(zhì)，這些樣品可能需要經(jīng)過一些預(yù)處理步驟，例如稀釋、裂解或純化，以去除干擾物質(zhì)并優(yōu)化檢測。ELISA的成功在很大程度上取決于所用抗體對的特異性和親和力。因此，驗證抗體是確保ELISA實驗準(zhǔn)確且可重復(fù)關(guān)鍵步驟。

  抗體驗證

  抗體驗證至關(guān)重要，如下原因：

  1.特異性：確保抗體僅與目標(biāo)抗原結(jié)合而不與其他蛋白質(zhì)結(jié)合。

  2.靈敏度：甚至可以檢測到低濃度的抗原。

  3.可重復(fù)性：在不同的實驗和實驗室中獲得一致的結(jié)果。

  4.準(zhǔn)確度：正確量化目標(biāo)抗原。

  在之前的文章《抗體選擇：如何區(qū)分好抗體和壞抗體》提到抗體驗證的五大支柱有望提高可重復(fù)性，分別是遺傳策略、正交策略、獨立抗體策略和標(biāo)記蛋白的表達等。

  檢測特異性抗體驗證

  值得注意的是，針對各種抗體檢測，樣品的制備方式不同。對于流式細胞術(shù)和ELISA，蛋白質(zhì)通常為天然形式，而對于蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學(xué)和免疫細胞化學(xué)，蛋白質(zhì)則部分或完全變性。由于蛋白質(zhì)構(gòu)象和靶標(biāo)可及性不同，在一種檢測中效果良好的抗體可能在另一種檢測中表現(xiàn)不佳。這種復(fù)雜性使得很難建立一個單一的基準(zhǔn)來評估所有可能應(yīng)用中的抗體性能。因此，抗體驗證方法必須根據(jù)具體應(yīng)用和情況進行量身定制。

  夾心ELISA抗體驗證

  ELISA實驗檢測可溶性物質(zhì)，如肽、蛋白質(zhì)、抗體和激素。它們通常以“夾心”形式進行（圖）。夾心ELISA通過使用結(jié)合到ELISA板上的捕獲抗體來固定目標(biāo)蛋白質(zhì)，同時檢測抗體產(chǎn)生讀出信號來識別分析物。與間接形式相比，使用抗體對可顯著提高夾心ELISA的特異性和靈敏度，而抗體驗證是確保準(zhǔn)確和可重復(fù)結(jié)果的關(guān)鍵步驟。

  尋找并驗證ELISA抗體對

  1.了解目標(biāo)蛋白

  a.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)：抗體對與抗原表面的互補表位結(jié)合。必須了解靶蛋白的天然確認，以探索單個表位作為抗體靶標(biāo)的適用性。

  b.生物相關(guān)性：考慮您正在研究的生物環(huán)境中目標(biāo)蛋白質(zhì)的作用和表達。

  c.翻譯后修飾(PTM)、異構(gòu)體和裂解產(chǎn)物：注意任何可能影響抗體結(jié)合的修飾。

  2.包括適當(dāng)?shù)目刂?

  a.表達確認：確保目標(biāo)蛋白質(zhì)在所選樣本中表達。

  b.對照：使用陽性和陰性對照來驗證抗體特異性。

  3.抗體驗證

  確保公司驗證數(shù)據(jù)是在與您要求的相同樣品類型中進行的，因為基質(zhì)效應(yīng)可能會干擾抗體結(jié)合。您可以使用加標(biāo)和回收率以及稀釋線性來測試樣品類型中抗體對的適用性。

  如果需要，請按照抗體驗證的五大支柱進行進一步驗證。

  4.確定最佳抗體濃度

  進行棋盤滴定以確定捕獲和檢測抗體的最佳濃度。

  ELISA檢測驗證

  為了驗證用于測量生物流體中分析物濃度的ELISA方法，根據(jù)Andreasson等人在論文“免疫測定方法驗證實用指南”中描述的指導(dǎo)原則，建議執(zhí)行以下步驟：

  精度：重復(fù)測量的接近程度的度量

  1.運行內(nèi)精度：在一次運行中分析至少兩個樣品（一個高濃度，一個低濃度）的多個重復(fù)樣品。

  2.運行間精度：分析不同運行和日期內(nèi)同一樣品的多次重復(fù)實驗。

  靈敏度：通過分析已知低濃度的樣品確定定量限(LOQ)。LOQ是可以以可接受的精度和準(zhǔn)確度可靠地定量分析物的最低濃度。

  基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)中存在的物質(zhì)產(chǎn)生的干擾。可以通過稀釋樣品來減少基質(zhì)效應(yīng)。可以通過在樣品中加入目標(biāo)分析物并分析回收率來檢查基質(zhì)效應(yīng)。

  蛋白質(zhì)穩(wěn)定性：評估樣品中分析物在不同儲存條件下（例如室溫、4°C、-20°C）以及多次凍融循環(huán)后的穩(wěn)定性。這對于避免與樣品采集和儲存相關(guān)的系統(tǒng)誤差非常重要。

  交叉反應(yīng)測試：測試抗體與一組相關(guān)蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)。此步驟可確保抗體對目標(biāo)抗原具有特異性，并且不會與其他蛋白質(zhì)上的類似表位結(jié)合。Blast®等工具在此過程中非常有用。

  ELISA故障排除

  盡管經(jīng)過嚴格驗證，ELISA過程中仍可能出現(xiàn)一些問題。以下是常見問題及其潛在解決方案：

  1.非特異性結(jié)合

  問題：背景信號高或非特異性結(jié)合。

  解決方法：優(yōu)化阻斷條件和洗滌步驟。

  2.低靈敏度

  問題：目標(biāo)抗原檢測不佳。

  解決方案：檢測前30分鐘將所有試劑放置于室溫下，以一定角度移液，不要接觸孔底，對樣品進行連續(xù)稀釋，使其處于可檢測范圍內(nèi)

  3.結(jié)果不一致

  問題：重復(fù)或測定之間的差異性。

  解決方案：標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)議，確保試劑質(zhì)量的一致性（例如，批次間差異），并保持嚴格的環(huán)境控制（例如，溫度）。

  抗體驗證是ELISA開發(fā)的關(guān)鍵組成部分，可確保檢測結(jié)果的可信度。通過遵循特定應(yīng)用的驗證策略并遵守既定指南，研究人員可以顯著提高實驗結(jié)果的可靠性。