什么是PCR（聚合酶鏈式反應）？PCR 是一種在實驗室中使用的技術，用于復制特定 DNA 片段的數(shù)百萬個副本。聚合酶鏈式反應 (PCR) 最初由美國生物化學家 Kary Mullis 于 1983 年開發(fā)。因其開創(chuàng)性工作，他于1993年榮獲諾貝爾化學獎。在Covid-19 大流行期間，通過PCR技術檢測一個人是否感染該病毒。
  

  PCR是如何工作呢？

  

    PCR反應體系及作用

  1、要復制的 DNA 模板。
  
  2、引物——DNA 或 RNA 的短片段，長度為 20 到 30 個堿基，結合感興趣的 DNA 片段的任一側并標記 PCR 的起始點。
  
  3、DNA 核苷酸堿基（也稱為 dNTP）。 DNA 堿基（A、T、C 和 G）是 DNA 的組成部分，是構建新 DNA 鏈所必需的。
  
  4、一種稱為 Taq 聚合酶的酶，它將堿基添加到復制的序列中。
  

  5、緩沖液以確保反應有合適的條件。

PCR步驟

  
  PCR 具有三個主要階段，其中涉及加熱和冷卻過程：
  
  步驟1，變性：將雙鏈模板DNA加熱，使其分離成兩條單鏈。
  
  步驟2，退火：降低溫度，使DNA引物附著到模板DNA上。
  
  第三步，延伸：再次升高溫度，Taq聚合酶產生新的DNA鏈。
  
  這三個階段重復 20-40 次，每次 DNA 拷貝數(shù)加倍。這稱為熱循環(huán)，由機器執(zhí)行。
  
  它是由一臺稱為熱循環(huán)儀的機器執(zhí)行的。根據(jù)機器的速度，PCR 可以在不到一小時或長達幾個小時內完成。
  

  PCR 完成后，可以使用一種稱為電泳的方法來檢查產生的 DNA 片段的數(shù)量和大小。

聚合酶鏈式反應 (PCR) 中主要步驟的插圖

  

  PCR 的每個步驟詳解

  
  第一步：變性
  
  將反應混合物加熱至 94-95°C，持續(xù) 15 至 30 秒。
  
  高溫導致模板 DNA 兩條鏈中堿基之間的氫鍵斷裂，兩條鏈分離。
  
  這會產生兩條單鏈 DNA，它將作為模板產生每條 DNA 鏈的新副本。
  
  重要的是，在此階段保持溫度足夠長的時間，以確保 DNA 鏈完全分離。
  
  第 2 步：退火
  
  將反應冷卻，使引物能夠通過氫鍵連接到單鏈模板 DNA 上的特定位置。
  
  溫度取決于底漆的特性，但通常在 50 至 65?C 之間。
  
  兩條分離的 DNA 鏈是互補的，并且以相反的方向延伸（從一端 – 5' 端 – 到另一端 – 3' 端）。因此，有兩種引物——正向引物和反向引物。
  
  此步驟至關重要，因為引物通過提供供聚合酶使用的短雙鏈 DNA 區(qū)域而充當 DNA 合成的起點。只有引物結合后，聚合酶才能附著并開始在延伸步驟中從松散的 DNA 堿基生成新的互補 DNA 鏈。
  
  退火步驟通常需要大約10-30秒。
  

  第三步：擴展

  
  熱量升至 72?C，以便通過添加 DNA 堿基的特殊 Taq DNA 聚合酶生成新 DNA。
  
  Taq DNA 聚合酶是一種取自水生棲熱菌 (“Taq”) 的酶：
  
  這種細菌通常生活在溫泉中，可以耐受80℃以上的溫度，但最適溫度為72℃。
  
  該細菌的 DNA 聚合酶在高溫下非常穩(wěn)定，這意味著它可以承受在 PCR 變性階段將 DNA 鏈分開所需的溫度。
  
  大多數(shù)其他生物體的 DNA 聚合酶無法承受如此高溫。例如，人類聚合酶在 37°C（體溫）下工作效果最佳。
  
  在 72?C 時，Taq 聚合酶開始構建互補鏈。它附著在引物上，然后沿 5' 到 3' 方向將 DNA 堿基一一添加到單鏈上。
  
  結果是一條全新的 DNA 鏈和雙鏈 DNA 分子。
  
  此步驟的持續(xù)時間取決于被擴增的 DNA 序列的長度。復制 1,000 個 DNA 堿基通常需要大約一分鐘。
  
  第四步：重復該過程
  
  這三個熱循環(huán)過程重復 20-40 次，以產生大量感興趣的 DNA 序列的副本。
  
  PCR 過程中產生的新 DNA 片段也可以作為 DNA 聚合酶可以附著并開始產生 DNA 的模板。
 

  結果是在相對較短的時間內產生大量特定 DNA 片段的拷貝。

插圖顯示聚合酶鏈式反應 (PCR) 如何產生大量 DNA 副本

  上述是通蔚為大家介紹了什么是PCR（聚合酶鏈式反應），了解PCR原理及步驟，有助于計和執(zhí)行PCR實驗操作。如果您對PCR還有疑問，歡迎前來咨詢。