上篇我們認識qPCR，對比PCR之間區別，知道qPCR，你應該接觸到染料法PCR和熒光探針法PCR。它們都屬于qPCR（實時定量PCR技術）。今天，主要講下探針法PCR工作原理，對探針法PCR有個全面的認識。關于qPCR，可以參考《qPCR：實時定量 PCR 技術》

  什么是探針法PCR?

  探針法的qPCR是一種PCR方法，它使用熒光標記的序列特異性DNA寡核苷酸（稱為探針）來獲得非常準確和特異的結果。使用探針不僅需要設計引物，還需要設計探針（下文有介紹），這可能會使實驗比使用基于染料的qPCR更加耗時和昂貴。

  探針法PCR是如何工作？

  再開始使用探針的qPCR，您需要的探針在其一端包含熒光報告染料，在另一側包含猝滅元件，通過吸收報告基因發出的光來防止熒光。熒光報告染料和猝滅劑的位置彼此靠近，以便猝滅劑阻止熒光。在設計引物和探針時考慮引物和探針的位置也很重要。探針應位于序列中間的引物之間。在PCR過程中，探針定位引物下游并與互補靶標結合。然后，熒光報告染料和猝滅劑被TaqDNA聚合酶分離，該酶會裂解探針。這使得熒光信號被釋放，qPCR機器將測量該信號，然后用于定量樣品中的DNA量。（圖1）

圖1 TaqMan 探針法原理示意圖

  這種方法的好處是您可以確定信號來自預期目標，因為只有引物和探針與正確的序列結合時您才能獲得信號。前提是探針和引物設計良好并且不會非特異性地結合到其他地方。

  除了更高的特異性（與基于染料的qPCR相比）之外，基于探針的qPCR還可以節省反應完成后分析qPCR結果的時間，因為您不需要弄清楚您正在查看的是否正確目標放大與否。由于探針的特異性，如果您沒有大量目標材料或想要檢測目標中的微小變化（如SNP（單核苷酸多態性）），它們也很有用。

  如前所述，基于探針的qPCR可用于多重檢測。這意味著通過使用攜帶不同報告染料的不同標記探針可以在單個反應中檢測多個序列。由于在不同通道中檢測到不同的熒光團，因此稍后可以區分哪一個目標被擴增。與使用單重分析相比，這可以使實驗更快、更便宜。盡管如此，重要的是要記住在混合物中添加更多的反應組分或使用專為多重檢測而設計的指定試劑，這樣就不會出現競爭，從而限制一個或多個目標的擴增。

  如何設計探針？

  探針法PCR最困難的部分可能是設計探針。一旦完成，其他一切實際上與基于染料的qPCR（后期要討論的）沒有什么不同。

  當開始設計探針時，明智的做法是同時記住引物，以避免自我互補并確保其對靶標的特異性。運行BLAST比對很可能會對此有所幫助。您還可以嘗試其他軟件，如SnapGene、Benchling等。探針的位置應靠近引物（約50bp），但不能重疊。應以中等量（~50%）的GC含量為目標，以允許復雜性，同時保持獨特的序列。此外，探針不應太長（~30bp），否則將難以正確猝滅熒光。探針的熔解溫度應略高于引物(8-10°C)，以確保更好的靈敏度。在循環程序中，退火溫度應設置為比引物熔解溫度下限低最多5°C，以實現特異性結合。大多數探針設計程序也會告訴您要記住這些建議，但根據實驗的不同，可能需要進行優化。

  在計劃多重實驗時，設計帶有報告熒光團的探針非常重要，這些熒光團具有足夠不同的激發和發射波長，以便qPCR機器可以區分它們。猝滅劑還必須與報告基因相匹配。此外，請確保您的qPCR機器實際上能夠讀取所有熒光團信號，以及您是否擁有無ROX、高ROX或低ROX機器。

最后您應該知道qPCR有不同的探針變體，這些變體也有變體，這些變體有修改，所以確實有很多選項可供選擇。最流行的是水解探針（例如TaqMan®），它們有利于定量和多重分析。然后還有分子信標，它們被認為更具特異性，可用于SNP檢測等。

上述是探針法 PCR 工作原理詳解，內容比較多和抽象，大家看完文章后可以對照自己的實驗進行操作，通過實驗加深原理的理解。如果對探針法PCR還有疑問，可以尋求在線技術顧問幫助。如果您想了解更多探針法PCR試劑盒，歡迎前來咨詢。