ELISA檢測抗體所標(biāo)記的酶（通常是 HRP 或 AP）決定了 ELISA 實(shí)驗(yàn)可用的檢測方法。最常用的三種檢測方法是比色法、熒光法和化學(xué)發(fā)光法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需的靈敏度、定量的動(dòng)態(tài)范圍、信噪比等選擇檢測方法。

  比色測定

  ELISA實(shí)驗(yàn)最常用的檢測方法是比色法。通常，辣根過氧化物酶 (HRP) 或堿性磷酸酶 (AP) 偶聯(lián)抗體用于與底物（例如TMB ）進(jìn)行顯色反應(yīng)。這是通過測量吸光度來檢測的，并通過創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線或比較樣品的顏色來量化。

  化學(xué)發(fā)光分析

  第二種檢測方法是利用過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。在此方法中，將基于魯米諾的增強(qiáng)劑溶液與底物一起添加以產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，并使用光度計(jì)進(jìn)行檢測。當(dāng)需要寬動(dòng)態(tài)范圍時(shí)，使用化學(xué)發(fā)光檢測。

  熒光測定

  第三種檢測方法使用帶有熒光底物的過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體。該方法可以產(chǎn)生更高的信號(hào)和更寬的動(dòng)態(tài)范圍。然而，熒光底物的半衰期通常比比色底物短，并且染料的漂白可能是一個(gè)問題。

  使用黑色多孔板進(jìn)行熒光測定，以盡量減少背景。用熒光計(jì)檢測從酶促反應(yīng)獲得的熒光信號(hào)。

  如何確保ELISA實(shí)驗(yàn)的獲得理想的結(jié)果

  起始材料是關(guān)鍵。為您的 ELISA 選擇合適的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備非常重要。就像微孔板設(shè)計(jì)這樣簡單的事情都會(huì)影響收集的數(shù)據(jù)。由于測量的是光作為反應(yīng)終點(diǎn)，因此選擇透明板進(jìn)行比色，選擇黑色板進(jìn)行熒光檢測，選擇白色板進(jìn)行發(fā)光 ELISA 檢測。

  例如，在測量熒光測定時(shí)，使用避免孔之間光散射的材料非常重要。使用專為熒光測定設(shè)計(jì)的板還可以避免塑料發(fā)出的熒光。科研人員應(yīng)該意識(shí)到某些生物體液會(huì)顯示背景熒光；適當(dāng)?shù)南♂尣襟E可以幫助防止這種干擾。

  孔內(nèi)充分混合也是一個(gè)優(yōu)先事項(xiàng)。考慮在您的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置中使用微孔板搖床或帶有集成搖床的讀板器。優(yōu)化您的工作流程還可以創(chuàng)建良好的數(shù)據(jù)：通過防止分析物蒸發(fā)并確保正確移液來最大限度地減少邊緣效應(yīng)，這意味著微孔板中的所有孔都能提供良好的無偏差結(jié)果。

  與所有實(shí)驗(yàn)室方案一樣，關(guān)注測定設(shè)計(jì)并了解所研究的分析物是 ELISA 成功的關(guān)鍵。