發布時間:2024-09-18 發布作者:上海通蔚生物
ELISA(酶聯免疫吸附試驗)是一種用于量化樣本中目標靶標的技術。常見樣本包括血液(血清和血漿)、組織勻漿、細胞裂解物和細胞培養上清液。ELISA獲得的結果可能受到樣本的收集、處理和儲存方式的影響。本問為您介紹ELISA樣本處理方法。
目錄:
全血樣本含有多種成分。主要成分是血細胞(紅細胞、白細胞和血小板)和血液的液體成分。全血可以離心,使血細胞與血液分離。根據血液的制備方式,所得液體將是血清或血漿。
血清
血清是血液中不含血細胞或凝血因子的成分。它本質上與血漿相同,但不含纖維蛋白原。凝固的血液會產生不含纖維蛋白原的血清,但可能殘留一些凝血因子。
制備方案:
1.使用血清分離管收集血清,在室溫下靜置1-2小時或在4°C下靜置過夜。
注意:血液樣本靜置后會自然凝結;溫度越低,凝結過程越慢。
2.以1000×g的速度離心20分鐘。
3.將上清液轉移到干凈的試管中并立即分析或儲存在4°C(最多一周)、-20°C(最多一個月)或-80°C(最多兩個月)下。避免反復凍融。在進行分析前將樣品恢復至室溫。
血漿
血漿是血液的一種成分,構成血細胞(紅細胞、白細胞和血小板)周圍的細胞外基質。抗凝(未凝固)的血液會產生血漿,其中包括纖維蛋白原和凝血因子。如果目標分析物是凝血因子,建議使用血漿作為樣品類型,而不是血清。
血漿樣本需要抗凝。抗凝劑的選擇取決于目標分析物。通常使用2%EDTA、1%肝素或3.8%檸檬酸鈉。應避免溶血,因為這會釋放蛋白酶,從而導致樣本中存在的目標分析物降解。高脂質濃度會導致溶血,因此也應避免。
制備方案:
1.將血漿收集到含有所需抗凝劑的試管中。
2.收集后30分鐘內,在2-8°C下以1000×g離心15分鐘。
3.將上清液轉移到干凈的試管中并立即分析或儲存在4°C(最多一周)、-20°C(最多一個月)或-80°C(最多兩個月)下。避免反復凍融。在進行分析前將樣品恢復至室溫。
檸檬酸鈉
血液中的Ca2+通過鈣依賴性凝血途徑促進凝血。檸檬酸鈉螯合游離Ca2+離子,抑制這些途徑,從而防止凝血。
優點:適用于大多數情況,不影響凝血因子。
缺點:抗凝作用弱,溶解性差。
建議用法:檸檬酸鈉(109mmol/L):血液比例為1:9;或檸檬酸鈉(106mmol/L):血液比例為1:4。
乙二胺四乙酸
血液中的Ca2+通過鈣依賴性凝血途徑促進凝血。乙二胺四乙酸(EDTA)螯合游離的Ca2+離子,使其不再處于游離狀態,從而阻止凝血。
優點:適用于大多數情況,不影響紅細胞或白細胞。
缺點:影響血小板聚集,不適合檢測凝血或血小板因子。
建議使用方法:EDTA(15g/L):血液比例為1:10
肝素
抗凝血酶III是一種抑制凝血途徑中多種酶(主要是絲氨酸蛋白酶)的蛋白質。肝素與抗凝血酶III結合,將其激活,導致抗凝血酶III活性增加,從而增強抗凝血作用。
優點:抗凝效果強,不改變血細胞體積,高溫下穩定,不易溶血。
缺點:引起白細胞聚集,抗凝效果短暫。
建議用法:肝素(1g/L):血液比例為1:10。
組織勻漿的實驗方案取決于用作樣本的確切組織。可能需要添加蛋白酶抑制劑以防止目標分析物降解。一些組織樣本(如肝臟、腎臟、腦組織)可能會產生假陽性結果,因為內源性生物素會與親和素和鏈霉親和素相互作用。
制備方案:
1.用冰冷的PBS沖洗組織以去除多余的血液。在均質化之前稱量組織。
2.將組織切碎,在冰上用組織勻漿器在PBS中勻漿,并對細胞懸浮液進行超聲處理。
3.以5000×g的速度離心5分鐘,以去除所有沉淀物。
4.將上清液轉移到干凈的試管中并立即分析或儲存在4°C(最多一周)、-20°C(最多一個月)或-80°C(最多兩個月)下。避免反復凍融。在進行分析前將樣品恢復至室溫。
細胞必須先裂解才能進行ELISA檢測。細胞裂解可通過物理方法(如超聲波或凍融循環)或化學方法(如RIPA、TritonX-100、NP-40、SDS、脫氧膽酸鈉、β-巰基乙醇、DTT、尿素)誘導。通常,物理方法優于化學方法,因為化學洗滌劑會影響ELISA獲得的結果。建議使用1%濃度的TritonX-100和1%NP-40,因為這足以裂解細胞,同時對ELISA吸光度值沒有或幾乎沒有明顯影響。
建議方案:
1.用胰蛋白酶分離貼壁細胞,然后離心并收集上清液。對于懸浮細胞,離心并收集上清液。
2.用冰冷的PBS清洗細胞三次,然后用PBS重新懸浮。
3.用超聲波裂解細胞四次。或者,將樣品凍融(-20°C至室溫)三次。
5.在2-8°C下以1500×g離心10分鐘,以去除任何細胞碎片。
將上清液轉移到干凈的試管中并立即分析或儲存在4°C(最多一周)、-20°C(最多一個月)或-80°C(最多兩個月)下。避免反復凍融。在進行分析前將樣品恢復至室溫。
如果目標分析物是分泌蛋白,則建議使用細胞培養上清液作為樣品類型。
制備方案:
1.以1000×g的速度離心20分鐘,以去除所有沉淀物。
2.將上清液轉移到干凈的試管中并立即分析或儲存在4°C(最多一周)、-20°C(最多一個月)或-80°C(最多兩個月)下。避免反復凍融。在進行分析前將樣品恢復至室溫。
上述為大家介紹了常見ELISA樣本處理,正確的樣本處理有助于提高ELISA實驗的準確性。除了常見的樣本制備之外,根據目標分析物,可以測試其他樣本,例如皮膚、尿液、糞便、支氣管肺泡灌洗液、胸膜液、唾液、腦脊液等。本篇篇幅有限,下次詳細介紹。