一、為什么所有試劑和檢測樣本要平衡至室溫后再進行加樣操作？
溫度是ELISA結合反應的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應，實驗前務必將所有試劑平衡至室溫，包括檢測樣本。避免因溫度的動力學反應差異而導致ELISA試劑盒檢測結果的不準確。

二、如何獲得良好線性的標準曲線？
按照推薦方式保存標準品；溶解標準品之前需短暫離心，徹底收集粉末；確保標準品完全溶解和混勻（大約10min），然后再進行后續的系列稀釋步驟，確保每一步都充分混勻且精確移液；顯色的恰當終止；選擇合適的數學擬合方程繪制標準曲線。

三、ELISA實驗為什么必須設置復孔？
為獲得更準確的實驗結果，強烈建議標準品及樣本進行復孔檢測。因為復孔檢測可以：

計算平均值，確保實驗結果更準確；解決實驗中誤操作造成的跳孔現象；

計算CV值，對實驗的操作和試劑盒的精密度進行評估。
四、為什么實驗過程中孵育、洗滌需要振蕩？如何振蕩？
振蕩孵育使反應更充分，振蕩洗滌使背景更干凈。建議使用酶標專用96孔微孔板振蕩器。
孵育過程振蕩，可以加快、加強抗原抗體分子間的相互碰撞接觸，使得反應過程更加完全，OD值通常會比未振蕩孵育的結果要高；洗滌過程振蕩，可以使洗板更干凈，在很大程度上 能降低背景值，同時可以提高試劑盒檢測的靈敏度。

五、何時終止ELISA反應？
ELISA實驗最終需要酶催化底物顯色反應來完成，在最佳時間終止反應是ELISA試劑盒實驗成功的重要因素。在HRP-TMB酶促反應系統中，S5出現淡藍色，S1 – S3有明顯的階梯型藍色，便需要終止反應；或者根據最高濃度標準品孔在620nm的OD值來決定，OD620=0.9-0.95之間時即可終止。

六、為什么酶標儀讀數時必須選用雙波長？
首先，酶標儀使用前務必預熱10-15min，使測讀結果更穩定。其次，ELISA實驗采用雙波長測定吸光度，可以排除單波長檢測時的測定干擾（標本的濃度，干擾色等）。一般采用最大波長作為參照波長，在參照波長下，檢測物的吸光值最小，檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收；因此，雙波長測定，可最大限度的消除指紋、雜質及不透光的物質對酶標儀讀數帶來的誤差，以保證實驗數據的準確度。